摘要：旨在探究油酸诱导脂毒性介导血管内皮细胞衰老机制及荷叶碱对其干预作用。以体外培养人血管内皮细胞系作为研究对象，通过油酸暴露诱导血管内皮细胞衰老，RNA干扰（siRNA）构建SIRT6基因沉默细胞，采用SRB法测定细胞活力，Western blot检测β-半乳糖苷酶（β-Gal）蛋白表达及显色底物染色检测细胞衰老，PI单染后流式细胞术检测细胞周期分布，Western blot和荧光定量PCR方法检测p16、p21和p53蛋白和mRNA表达水平。结果表明，高浓度油酸（900 μmol/L）孵育72 h显著抑制细胞增殖，上调β-Gal蛋白表达水平和阳性着色细胞比例，并阻滞细胞周期于G0/G1期，且浓度依赖性诱导p21、p16和p53的蛋白和mRNA表达升高。荷叶碱对细胞增殖无明显影响，但显著拮抗油酸诱导的β-Gal表达上调和细胞阳性着色，下调油酸诱导的p21、p16和p53的蛋白和mRNA表达上调。分子对接分析表明，荷叶碱与Sirtuins家族中Sirt6的结合能力最强。荷叶碱明显逆转油酸诱导的Sirt6蛋白和mRNA表达下调。Sirt6基因沉默致荷叶碱对油酸诱导衰老相关因子表达上调的拮抗作用消失。提示Sirt6介导了荷叶碱逆转油酸诱导的血管内皮细胞衰老。
文章目录
1 材 料
1.1 材料与试剂
1.2 仪器与设备
2 方 法
2.1 血管内皮细胞培养
2.2 磺酰罗丹明B(SRB)染色检测细胞活力
2.3 构建SIRT6基因沉默的血管内皮细胞
2.4 β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老
2.5 实时荧光定量PCR检测相关基因的表达
2.6 Western blot 检测相关蛋白表达水平
2.7 荷叶碱与Sirtuins家族分子对接分析
2.8 统计分析
3 实验结果
3.1 油酸诱导HUVECs增殖抑制和衰老表型
3.2 油酸诱导HUVECs周期阻滞
3.3 荷叶碱对HUVECs增殖的影响
3.4 荷叶碱逆转油酸诱导的HUVECs衰老
3.5 分子对接表明荷叶碱与Sirtuins家族Sirt6结合能力最强
3.6 荷叶碱逆转油酸诱导HUVECs中 Sirt6的表达下调
3.7 SIRT6基因沉默消除了荷叶碱抗血管内皮细胞衰老
4 讨 论
5 结 论
