摘要：目的：评价如意珍宝丸(RYZBW)对出血性脑卒中小鼠继发性脑损伤及中枢痛的干预效果，并从神经炎症角度探索其修复神经-血管单元的药理机制。方法：以Ⅳ型胶原酶丘脑腹后外侧核区显微注射的方式构建小鼠卒中后中枢痛(CPSP)模型，构建当天记为D1并分为假手术组(Sham)、模型组(CPSP)、如意珍宝丸低(RYZBW-L)、中(RYZBW-M)、高(RYZBW-H)剂量组和阳性药普瑞巴林组(PGB)。模型构建后D4，进行一天2次的灌胃给药。Sham及CPSP给予等体积生理盐水，RYZBW-L、RYZBW-M、RYZBW-H组单次给予0.6067、0.9101、1.2134 g·kg-1如意珍宝丸，PGB组单次给予0.02275 g·kg-1普瑞巴林；分别于建立模型前1 d(记为D0)、建立模型后第三天(记为D3)及建立模型第四天(记为D4)第一次灌胃给药后检测机械痛敏，D1及D4第2次灌胃给药后评价神经损伤。D4取外周血进行血常规检测，取丘脑进行免疫炎症芯片分析。在独立样品中，以免疫荧光双标染色及酶联免疫吸附测(ELISA)、蛋白免疫印迹法(Western blotting)对相关免疫炎症因子-受体-细胞定位进行定量分析。结果：与Sham组相比，CPSP小鼠具有显著的继发性神经损伤(P＜0.01)，卒中后中枢痛(P＜0.05)，外周血红细胞分布宽度(RDW)显著增高(P＜0.01)，血红蛋白浓度(HGB)显著下降(P＜0.01); CPSP组丘脑炎症芯片结果表明CCL2显著增加(P＜0.01)、CX3CL1显著降低(P＜0.05)；CPSP组ELISA结果表明丘脑CCL2显著升高(P＜0.01)，这与免疫炎症芯片结果一致；CPSP组免疫荧光结果表明CX3CL1表达显著降低(P＜0.05)；小胶质细胞标志物TMEM119及CX3CL1受体CX3CR1的免疫荧光染色结果显示，CPSP组CX3CR1总体表达量无显著变化，但CX3CR1+TMEM119+的小胶质细胞数量(P＜0.01)及胞体面积(P＜0.01)显著增加，小胶质细胞上CX3CR1受体表达显著增加(P＜0.01)；CPSP组Western blot实验结果显示CX3CR1的蛋白表达量显著降低(P＜0.01)；单核细胞标志物Ly6C及CX3CR1的免疫荧光染色结果显示，CPSP组CX3CR1总体表达量显著降低(P＜0.01)，Ly6C+CX3CR1+的非典型单核细胞数量无显著变化，而CX3CR1-Ly6C+的典型单核细胞的数量显著增加(P＜0.01)。与CPSP组相比，RYZBW剂量依赖性地改善神经损伤(R2=0.3679)及中枢痛症状(R2=0.5019)；RYZBW-H显著改善外周血RDW(P＜0.05)及HGB(P＜0.05)；免疫炎症芯片结果显示，RYZBW-H显著抑制CCL2表达(P＜0.01)并提高CX3CL1表达(P＜0.05)；ELISA结果显示，RYZBW-H显著下调CCL2(P＜0.05)；对CX3CL1的免疫荧光染色结果显示，RYZBW剂量依赖性地升高CX3CR1总体表达量(R2=0.6196)，各个剂量有效下调小胶质细胞上CX3CR1受体表达，并剂量依赖性地降低小胶质细胞数量(R2=0.4945)及胞体面积(R2=0.5717)；Western blotting实验结果显示RYZBW-L/H组的CX3CR1的蛋白表达显著升高(P＜0.05)；与CPSP组相比，RYZBW剂量依赖性地增加CX3CR1+Ly6C+(R2=0.6353)的非典型核细胞浸润，并有效抑制Ly6C+CX3CR1-(R2=0.4836)的典型单核细胞浸润。结论：RYZBW可有效缓解CPSP小鼠继发性损伤及中枢痛，其机制与调控CX3CL1-CX3CR1配体-受体、抑制小胶质细胞浸润及激活、促进血管修复性的非典型单核细胞浸润并抑制炎症吞噬性的典型单核细胞浸润有关。
文章目录
1 材料
1.1 动物
1.2药品与试剂
1.3仪器
2 方法
2.1 动物模型的制备
2.2 分组及给药
2.3 检测方法
2.3.1 小鼠行为学评价
2.3.1.1 up-down法检测小鼠机械痛
2.3.1.2 神经功能缺损评分
2.3.2 小鼠血常规因子检测
2.3.3 Luminex液相悬浮芯片技术检测丘脑炎症因子
2.3.4 免疫荧光检测小鼠丘脑组织中CX3CL1、TMEM119、CX3CR1及Ly6C的表达情况
2.3.5 ELISA法验证核心靶点
2.3.6 蛋白免疫印迹法验证相关蛋白表达水平
2.4 统计学分析
3 结果
3.1 对CPSP小鼠亚急性期机械痛阈的影响
3.2 RYZBW对CPSP小鼠亚急性期神经功能缺损评分的影响
3.3 RYZBW对CPSP小鼠亚急性期血液中红细胞分布宽度（RDW）、血红蛋白浓度(HGB)的影响
3.4 RYZBW对CPSP小鼠亚急性期丘脑组织中炎症因子的影响
3.5 RYZBW对CPSP小鼠亚急性期丘脑组织中小胶质细胞胞体面积、数量和CX3CR1受体表达的影响
3.6 RYZBW对CPSP小鼠亚急性期丘脑组织中经典型-非经典型单核细胞趋化的影响
4 讨论
