机体自由基水平过高导致的氧化损伤是引起人类癌症、糖尿病、动脉硬化及神经退行性病的主要原因之一,抗氧化肽可以清除自由基从而具有预防或治疗疾病的作用。因此,抗氧化剂的开发已经成为当前的研究热点。榛蘑学名为蜜环菌,其蛋白质含量丰富,是生物活性肽的良好来源之一。目前常以食用为主,关于其功能成分的研究主要集中在多糖上,蛋白及肽的研究鲜有报道。本研究先从榛蘑中制得榛蘑蛋白,再用超声辅助风味蛋白酶水解得到榛蘑蛋白肽;利用超滤、葡聚糖凝胶柱层析纯化榛蘑蛋白肽后,以DPPH自由基清除、羟基自由基清除、ABTS自由基清除和总还原力为指标,测定了榛蘑蛋白肽及经逐级分离纯化得到的各榛蘑肽组分的抗氧化活性;通过液质联用对高活性榛蘑抗氧化肽组分进行结构鉴定;进行肽的固相合成筛选较高抗氧化活性的榛蘑肽序列;进一步研究榛蘑抗氧化肽对氧化损伤的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的保护作用。主要结果如下:1.采用碱提和超声分步法提取榛蘑蛋白:结果表明,分步提取方法可大幅提高蛋白提取率。碱提法的条件为:料液比为1:47,碱提pH为10.0,碱提时间为1.55 h,温度为80℃。离心收集上清液后,对废渣再进行超声处理,处理条件为:超声功率为200 W,超声时间为15 min,料液比为1:47,超声pH为9.0,超声温度为30℃,此条件下榛蘑蛋白的提取率为76.59%。榛蘑蛋白质沉淀的方法为先进行等电点沉淀(pI=3.7),后用90%的饱和硫酸铵盐析。经冷冻干燥后得榛蘑蛋白干粉。2.超声辅助风味蛋白酶水解制备榛蘑肽:结果表明,超声可以提高风味蛋白酶的水解度及水解产物的抗氧化活性。响应面优化后得出最佳水解条件为:在底物浓度为4%条件下,超声功率为200 W,超声处理时间为15 min,然后加入风味蛋白酶,pH调为7.0,酶浓度为3.5%,水解温度为41℃,水解时间为3 h,此时,蛋白质水解度达到16.32%。经冷冻干燥后得榛蘑肽干粉。3.榛蘑肽的分离纯化、结构鉴定及其抗氧化活性分析:结果表明,与总肽相比,超滤中得到的<3 kD的组分抗氧化活性更高,其DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率、ABTS自由基清除率和总还原力分别达到92.37%、96.75%、97.68%和1.26。对<3 kD的肽组分进行Sephadex G-25柱层析,发现组分A2具有更高的抗氧化活性,其DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率、ABTS自由基清除率和总还原力分别达到97.01%、100%、100%和1.62。采用液质联用和从头测序对组分A2进行结构鉴定。结合BIOPEP数据库筛选出7条肽进行固相合成,利用体外抗氧化指标进行筛选得到抗氧化活性高的2条肽段,分别为肽3(FDHEW)和肽6(WDPVH)。4.细胞试验检测榛蘑肽的抗氧化活性:结果表明,5种榛蘑抗氧化肽(总肽、<3 kD、A2、合成肽3、合成肽6)对氧化损伤后的SH-SY5Y细胞具有良好的保护作用。在浓度为2 mg/mL时,与总肽和<3 kD相比,A2组分的细胞活力最高。在浓度为200μM时,固相合成的肽3的细胞活力高于肽6。与模型组相比,5种榛蘑抗氧化肽均能提高细胞SOD、CAT、GSH-Px和ATPase活力。在浓度为2 mg/mL条件下,A2作用下的细胞GSH-Px和CAT活力最高;<3 kD作用下的细胞SOD活力最高;总肽作用下的细胞ATPase活力最高。在200μM浓度下,肽3作用下细胞的SOD、CAT和GSH-Px活力均高于肽6,而肽6的ATPase活力高于肽3。
